اختبار أوكسيديز: الأساس ، الإجراء والاستخدامات

اختبار أوكسيديز هو وسيلة تشخيصية توضح وجود مجمع الإنزيم الذي يدعى cytochrome oxidase c. يحفز هذا النظام على تحويل السيتوكروم المنخفض إلى أكسدة ، لأنه يلتقط الأكسجين وهذا بدوره يعمل كآخر مستقبل للإلكترون (H +) في السلسلة التنفسية.

مصطلح أوكسيديز هو شكل موجز للإشارة إلى إنزيم السيتوكروم أوكسيديز ، المعروف أيضًا باسم أوكسيديز إندوفينول. في العصور القديمة ، كان يعتقد أن الإنزيمات السيتوكروم أوكسيديز وإندوفينول أوكسيديز هما إنزيمان مختلفان ، لكن من المعروف اليوم أنهما متماثلان.

من ناحية أخرى ، السيتوكروم عبارة عن بروتينات دموية تحتوي على الحديد وتكمل نظام أوكسيديز السيتوكروم. السيتوكرومات يمكن أن تختلف من نوع إلى آخر.

هناك أنواع مختلفة من السيتوكرومات (السيتوكرومات a1 و a2 و a3 و 0). يمكن أن تنتج بعض البكتيريا واحدة فقط ، ولكن البعض الآخر يصل إلى اثنين أو ثلاثة في وقت واحد. في هذا المعنى ، فإن وجود السيتوكروم a و a3 يُعرف باسم السيتوكروم أوكسيديز ج. هذا هو نوع السيتوكروم الذي يكتشف اختبار أوكسيديز.

تحتوي أجناس النيسرية والزائفة على السيتوكروم أوكسيديز ج. تعطي هذه الأجناس اختبار الأكسيداز الإيجابي ، مما يساعد على التمييز بينها وبين الجينات Acinetobacter و Stenotrophomonas على التوالي.

هناك أيضًا أنواع أخرى إيجابية للأكسيداز.

مؤسسة

خصائص نظام السيتوكروم أوكسيديز ج

يعمل نظام السيتوكروم أوكسيديز ج على النحو التالي: تستخدم الكائنات الحية الدقيقة الإيجابية في أوكسيديز الأكسجين لتوليد الطاقة من خلال التنفس الهوائي. يعمل هذا النظام بفضل نقل الإلكترونات من المواد المانحة مثل NADH + إلى مستقبلات المواد ، في هذه الحالة الأكسجين.

ينتج عن هذا إنتاج الطاقة (ATP) والمياه أو بيروكسيد الهيدروجين ، اعتمادًا على نظام السيتوكروم أوكسيديز الذي تمتلكه الكائنات الحية الدقيقة.

هذا هو السبب في أن معظم بكتيريا أوكسيديز الإيجابية إيجابية أيضًا في الكاتالاز ، وهو شرط ضروري للقضاء على بيروكسيد الهيدروجين المنتج ، لأن هذه المادة سامة للبكتيريا.

يتواجد نظام السيتوكروم أوكسيديز ج في بعض أنواع البكتيريا الهوائية ، وبعض اللاهوائية الاختيارية ، وعدد قليل من الميكروفيلات الحيوية ، ولا توجد لاهوائية صارمة. هذا الأخير مفهوم ، لأن اللاهوائية الصارمة لا يمكن أن تعيش في وجود الأكسجين ، لذلك فهي تفتقر إلى نظام السيتوكروم أوكسيديز.

مبدأ الاختبار

في هذا الاختبار ، يستخدم المواد التي تعمل كمقبلات صناعية للإلكترونات ، لتحل محل المواد الطبيعية داخل سلسلة نقل الإلكترون.

تستخدم في المقام الأول الأصباغ مثل البارافينيلينيديامين والإندوفينول ، والتي تعمل بمثابة مستقبلات الركائز والمانحين الإلكترون الاصطناعي.

يتأكسد البارافينيلين أميدين بواسطة نظام السيتوكروم أوكسيديز c. الصبغة في شكلها المخفض عديم اللون ، ولكن في شكلها المؤكسد تكون ملونة.

هذه هي الطريقة التي يظهر بها وجود نظام السيتوكروم أوكسيديز c ؛ كرد فعل إيجابي سيولد تلوين لافندر أو أزرق بنفسجي حسب الكاشف المستخدم.

من ناحية أخرى ، إذا كان آخر مادة قبول للإلكترون في السلسلة التنفسية مختلفة عن الأكسجين ، فإن اختبار أوكسيديز سيكون سالبًا (لا يوجد إنتاج لوني) ؛ هذا هو حال الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية.

وبالمثل ، إذا كان السيتوكروم المستخدم من قبل الكائنات الحية الدقيقة يختلف عن السيتوكروم أوكسيديز ج ، فسوف يعطي أيضًا اختبارًا سلبيًا.

عملية

لاختبار أوكسيديز هناك العديد من الكواشف والبروتوكولات ، مع كل نفس الغرض.

الكواشف

كاشف Kovacs ، كاشف Gordon و McLeod ، كاشف Nadi ، كاشف نجار ، Suhrland و Morrison ، واستخدام أقراص أوكسيديز.

-كوفاكس أوكسيديز كاشف

وهو يتألف من 1 ٪ رباعي ميثيل- فينيلينيديامين ثنائي هيدروكلوريد.

يتم تحضير كاشف Kovacs عن طريق إذابة 1 غرام من المادة المذكورة أعلاه في 50 مل من الماء المقطر. يتم تسخينه بمهارة حتى يذوب تماما. نقل إلى زجاجة العنبر ذات سعة كافية وإكمال الحجم إلى 100 مل بالماء المقطر. انتظر 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تخزينها في الثلاجة محمية من الضوء.

يتم وصفه بأنه كاشف Kovacs oxidase ، لتمييزه عن كاشف Kovacs المستخدم للكشف عن اختبار الإندول. هذا الكاشف هو الأكثر حساسية وأقل سمية ولكن أكثر تكلفة من بقية الكواشف.

سوف يتضح رد فعل إيجابي من خلال هذا الكاشف مع تغيير لون المستعمرة إلى الخزامى ، والذي يتحول بسرعة إلى اللون الأرجواني الأسود تقريبا. يتضح رد فعل سلبي لأنه لا يوجد تغيير في اللون من المستعمرة أو أنه يأخذ تلوين وردي طفيف. يمكن أن يغمق الوسط أيضًا ، لكن هذا لا يعني رد فعل إيجابي.

مع هذا الكاشف وقت التفاعل أمر بالغ الأهمية ، ويعتبر رد فعل إيجابي أن تغير اللون يحدث بين 5 إلى 15 ثانية.

- رد الفعل غوردون وماكليود

وهو يتألف من ثنائي هيدروكلوريد ثنائي ميثيل-ف-فينيلينيديامين ، المعروف أيضًا باسم ن-ثنائي ميثيل- فنيلينيديامين- ن أو مونو هيدروكلوريد مونين هيدروكلوريد. يتم تحضيره كما هو موصوف لكاشف Kovacs oxidase ، بديلاً عن المادة المعنية.

يكون هذا الكاشف أكثر استقرارًا بقليل من كاشف كوفاكس أوكسيداز ، على الرغم من أن جميع الكواشف التي تحتوي على فينيلينيديامين بي غير مستقرة.

رد الفعل هذا لاحق ، يتم تفسيره على أنه إيجابي مع ظهور اللون الأزرق الأرجواني في غضون 10 إلى 30 دقيقة.

-راكتيفو دي نادي

وهو يتألف من 1 ٪ α-naphthol في الكحول الإيثيلي (95 ٪ من الإيثانول) و 1 ٪ أمينوديميثيلانيلين. يتم تحضير الخليط في أجزاء متساوية ويستخدم الكحول الإيثيلي المطلق كمخفف ، حتى يتم الوصول إلى كمية كافية لمدة 100 مل.

- رد فعل نجار ، سورلاند وموريسون

وهو يتكون من 1 ٪ ف أمين أمين ميثيل ألانين أكسالات. تحضير بالطريقة نفسها كما هو موضح لكاشف أوكسيداز كوفاكس ، وتغيير للمادة المقابلة.

مع تحضير المحلول ، يتم تحضير الشرائط على النحو التالي: يتم تشريب شرائط ورقة التصفية Whatman No. 1 بحجم 6 - 8 سم مع كاشف أكسالات ثنائي ميثيل- فينيلينيديامين 1٪.

يُسمح لهم بالتجفيف دون ملامسة المعادن وتخزينها في زجاجات ذات غطاء لولبي مع المجففة وتخزينها في الثلاجة. هذه الشرائط مستقرة لمدة تصل إلى 6 أشهر.

إنه الكاشف الأكثر استقرارًا من كل ما ذكر ، القدرة على الاستمرار في محلول يصل إلى 6 أشهر. هناك نقطة أخرى مؤيدة هي أنها لا تلون الوسيط حول المستعمرة ، إذا تم استخدامها مباشرة على اللوحة.

يتم تفسير ظهور اللون الأحمر على أنه اختبار إيجابي.

- أقراص أوكسيديز

إنها أقراص تجارية مشربة بالكاشف لاختبار الأكسيداز. هناك العديد من العلامات التجارية التجارية في السوق.

استخدامه عملي للغاية ، حيث لا توجد حاجة لإعداد كواشف جديدة ، مما يسهل العمل. النتائج التي تم الحصول عليها موثوقة طالما تم الحفاظ على الأقراص بشكل صحيح.

بروتوكولات

طريقة اللوحة المباشرة ، الطريقة غير المباشرة على الورق واستخدام الأقراص المشربة بكواشف أوكسيديز.

- طريقة لوحة مباشرة

تضاف قطرتان أو 3 قطرات من أي من الكواشف المذكورة أعلاه لهذا الغرض مباشرة على المستعمرة (ق) الموجودة في صفيحة متوسطة الثقافة التي لا تحتوي على الجلوكوز.

يتم تغيير أو عدم تغيير لون المستعمرات ، وليس من الوسط. يعتمد زمن التفاعل الصحيح على الكاشف المستخدم.

طريقة -Directirect على الورق

قطع قطعة من ورق الترشيح (Whatman رقم 1) إلى حجم 6 سم 2 ووضعه داخل طبق بتري فارغة.

أضف 2 أو 3 قطرات من كاشف أوكاسيداز Kovacs إلى الورقة ، وشارك في المستعمرة التي تريد دراستها بمقبض بلاتيني أو بعصا خشبية وانشرها في خط مستقيم على الورق المشرب بالكواشف. ترجمة في فترة من 5 إلى 10 ثوان.

مع شرائط أعدت مع كاشف نجار ، Suhrland وموريسون تنتشر مستعمرة على الشريط الجاف. يتم استخدام نفس الشريط لاختبار عدة سلالات. ترجمة في 10 ثانية.

- الأقراص ( الطريقة المباشرة)

بلل الأقراص التجارية بمهارة باستخدام الماء المقطر المعقم وتثبيتها على المستعمرة المراد دراستها. يوصى باستخدام الألواح عند 35 درجة مئوية ، إذا تم استخدام الألواح في درجة حرارة الغرفة أو اللوحات المبردة ، يكون التفاعل أبطأ قليلاً. تفسير تغيير اللون بين 10 إلى 20 ثانية.

يمكن استخدام المستعمرات الموجودة في أجار الدم أو الشوكولاتة.

- الأقراص (طريقة غير مباشرة)

بلل القرص كما هو موضح أعلاه. ضعه في طبق بتري فارغ. خذ ما يكفي من المستعمرة للدراسة باستخدام مقبض بلاتيني أو عصا خشبية ووضعها على القرص. تفسير تغيير اللون بين 10 إلى 20 ثانية.

استعمال

يكون جنس النيسرية و Acinetobacter متشابهين في بعض الأحيان من الناحية الشكلية لأنه على الرغم من أن جنس Acinetobacter هو عصيدة سالبة الجرام ، فإنه في بعض الأحيان يمكن أن يتبنى شكلًا مخلوقًا ويتم توزيعه في أزواج ، مما يحاكي جنس النيسرية.

في هذه الحالة يكون اختبار أوكسيديز مفيدًا حقًا. جنس النيسرية هو إيجابي و Acinetobacter سلبي.

ومع ذلك ، فإن جنس Moraxella يشبه إلى حد كبير جنس النيسرية ويعطي كلاهما تفاعلًا إيجابيًا ؛ لهذا السبب عليك دائمًا إجراء اختبارات تخمير الكربوهيدرات لتحديد الهوية بشكل نهائي.

من ناحية أخرى ، فإن اختبار أوكسيديز مفيد للتمييز بين بكتيريا تنتمي لعائلة Enterobacteriaceae (كلها سلبية من أوكسيديز) من المخمرات الأخرى ، مثل جنس باستوريلا ، إيروموناس ، بليسيوموناس (إيجابية أوكسيديز).

جنس Vibrio و Helicobacter أيضا أوكسيديز إيجابية.

مراقبة الجودة

استخدم سلالات Escherichia coli المعروفة كعنصر تحكم سلبي وسلالات Pseudomonas aeruginosa كعنصر تحكم إيجابي.

القيود

- يجب استخدام الكريات الطازجة ، حيث تكون مدة صلاحيتها في المحلول في درجة حرارة الغرفة قصيرة لأنها غير مستقرة للغاية. المبردة يمكن أن تستمر بين 5 أيام إلى 2 أسابيع.

- الكواشف عديمة اللون ، فإذا غيرت اللون فينبغي التخلص منها. الأقراص التالفة واضحة لأنها تغميق بمرور الوقت.

رد فعل إيجابي مع أوكسيديز كاشف من Kovacs بين 15 -60 ثانية يعتبر رد فعل تأخر وبعد قضاء 60 ثانية ينبغي اعتبار سلبية.

- إن المستدمية النزلية تعطي تفاعلًا سلبيًا للأوكسيديز إذا تم استخدام أي كاشف مع ثنائي ميثيل - فينيلينيديامين ، ولكنه إيجابي إذا تم استخدام أوكسيديز كاشف من كوفاكس (رباعي ميثيل- فينيلينيديامين ).

وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز تتداخل مع الاختبار ، وإعطاء السلبيات الكاذبة.

- سلالات البورديتيلة السعال الديكي يمكن أن تعطي ردة فعل إيجابية خاطئة إذا جاءت من ألواح أجار الدم شديدة التركيز.

- استخدام مقابض (الحديد) المعدنية تعطي رد فعل إيجابي خاطئ.

توصيات

- لأن الكواشف غير مستقرة للغاية وتميل إلى التأكسد الذاتي ، فمن المستحسن تجميد قسامات من 1-2 مل وإخراجها حسب الحاجة.

- من الطرق الأخرى لتأخير الأكسدة الذاتية للكاشف هو إضافة حمض الأسكوربيك بنسبة 0.1٪ في وقت تحضير الكواشف.

-كما أن الكواشف غير مستقرة ، فمن المستحسن إجراء مراقبة الجودة أسبوعيًا.

- لا ينبغي أن تستخدم الكرات التي لا تجتاز اختبار مراقبة الجودة.