اختبار تجلط الدم: الأساس ، الإجراء والاستخدامات

اختبار تجلط الدم هو تقنية مخبرية تُستخدم لتسليط الضوء على وجود إنزيم تجلط الدم. هذا الانزيم له خاصية تخثر البلازما. كان لوب عام 1903 أول من وصف هذا الإنزيم.

يتم إجراء هذا الاختبار على الغلوتين إيجابية الجرام ، إيجابية الكاتلاز ، مما يسمح للتمييز بين سلالات المكورات العنقودية الذهبية عن بقية المكورات العنقودية ، لأنها الكائنات الحية الدقيقة الوحيدة ذات الأهمية السريرية التي تنتجها.

في هذا المعنى ، غالبًا ما يُطلق على أفراد عائلة المكورات العنقودية التي تقدم هذا الاختبار السلبي المكورات العنقودية سلبية المكورات.

هناك بعض السلالات غير S. aureus التي يمكن أن تنتج تجلط الدم ، مثل Staphylococcus schleiferi spp. Coagulans و S. hyicus و S. intermedius و S. delphini.

ومع ذلك ، فإن الثلاثة الأولى هي ذات أهمية سريرية على المستوى البيطري ونادراً ما يمكن العثور عليها كعامل مسبب للعدوى في البشر ، في حين أن S. delphini موجود فقط في البيئات البحرية.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التمييز بينهما بسهولة لأن S. hyicus و S. intermedius لا يخمران مانيتول و S. schleiferi spp coagulans لا يخمران المالتوز ، ولا trehalose ، في حين أن S. aureus لا تخمر هذه الكربوهيدرات.

تم ربط وجود إنزيم تجلط الدم بقسوة السلالات. ومع ذلك ، فإن هذه النظرية آخذة في الانخفاض ، بالنظر إلى حقيقة أن الأنواع الأخرى الخبيثة سلبية التجلط يتم رصدها قادرة على إنتاج التهابات مهمة.

مؤسسة

تنتج المكورات العنقودية الذهبية نوعين من تجلط الدم ، أحدهما لا يزال مرتبطًا بجدار الخلية ، ويطلق عليه أيضًا عامل التراص أو عامل تفاعل تجلط الدم (CRF) ، وعامل خارج الخلية يتم إطلاقه في الثقافات السائلة. هذا هو السبب في أنها تسمى coagulase المتحدة و coagulase الحرة على التوالي.

يدين إنزيم التخثر باسمه بالإجراء الذي ينتجه. هذا لديه القدرة على تحويل الفيبرينوجين إلى الفيبرين ، وخلق جلطة واضحة عندما يكون في البلازما ، وهذا يحاكي هذا الإنزيم نشاط الثرومبين من تتالي التخثر.

في الواقع ، واحدة من أكثر النظريات المقبولة هي أن منضمة التخثر تتفاعل مع تجلط الدم الحر لتفعيل عوامل التخثر. هذا التنشيط يولد مادة تعمل بطريقة مماثلة كما يفعل البروثرومبين ، وخلق مركب مع وظيفة الثرومبين.

الفرق مع شلال التخثر الطبيعي هو أن هذا التفاعل لا يحتاج إلى وجود الكالسيوم ولا يتأثر بالهيبارين.

لإجراء اختبار تجلط الدم ، يكفي أن نواجه ثقافة جديدة من المكورات العنقودية مع البلازما ويفضل أن يكون من الأرانب وبالتالي مراقبة تشكيل أم لا من الجلطة.

هناك تقنيات محددة للكشف عن تجلط الدم المتحد و تجلط الدم المتحد و الخالي في نفس الوقت.

بعض سلالات المكورات العنقودية الذهبية تعطي نتيجة إيجابية أسرع من غيرها. تتشكل سرعة تكوين الجلطة بشكل مباشر مع تركيز الجلطات المخثرة.

تُظهر تقنية اختبار تجلط الدم في الشريحة تجلط التجلط المرتبط وتقنية الأنبوب تكتشف كلاً من تجلط الدم المخاطي وخاليًا.

عملية

- اختبار تجلط الدم في الشريحة

المواد

شريحة كائن نظيفة

- رفرف الأرنب بشكل مفضل ، يمكن أيضًا استخدام بلازما الإنسان أو الخيول. يمكن شراء البلازما بالتجميد وتجديدها تجاريًا عند استخدامها أو يمكن استخدامها طازجًا (يتم تناولها حديثًا). البديل الآخر القابل للتطبيق هو استخدام الفيبرينوجين.

- محلول ملحي (0.85٪) معقم (SSF).

الحصول على البلازما الطازجة

استخراج الدم الوريدي البشري أو الحيواني. يمكن استخدام أي من مضادات التخثر التالية: EDTA أو أكسالات الكالسيوم أو الهيبارين أو سترات الصوديوم. تخلط جيدا والطرد المركزي. مطهر إزالة طاف (البلازما) ، دون خلايا الدم الحمراء وترسب في أنبوب معقمة.

تجميد البلازما المجففة

أعد تكوين كما هو محدد في مجموعة الأدوات التجارية.

الفيبرينوجين الطازج

باستخدام بلازما مدرجة ، امزج البلازما بالتساوي مع محلول مشبع من كلوريد الصوديوم. اسمحوا تترسب والطرد المركزي.

تجاهل طاف ، إعادة تعجيل يصل إلى 5 أضعاف حجمها مع الماء المقطر المعقم. إضافة 5 وحدات من الهيبارين لكل مل من الفيبرينوجين. تخزينها في أنبوب معقم.

تقنية

يتم وضع قطرة من المياه المالحة وقطرة من البلازما بشكل منفصل على شريحة. خذ مع البلاتين حلقة 1 أو 2 مستعمرات نقية من الكائنات الحية الدقيقة لفحصها.

خلط الحمل البكتيري في انخفاض البلازما وكرر العملية في انخفاض SSF. مراقبة النتائج على الفور. ستكون النتيجة الإيجابية هي النتيجة التي يتم فيها ملاحظة تشكيل تراص عياني (ترسبات بيضاء) بعد دقيقة واحدة من الجانب المتساقط مع البلازما.

إسقاط SSF بمثابة عنصر تحكم سلبي. إذا لوحظ تراص مع SSF ، وهذا يعني أن الكائنات الحية الدقيقة تتكدس ، لتكون قادرة على تقديم نتائج إيجابية خاطئة. في هذه الحالة ، يجب أن يكون مدعومًا باختبار الأنبوب.

يوصى أيضًا بتركيب تحكم إيجابي مع سلالة معروفة من S. aureus.

ترجمة

التلصيق في غضون 5 إلى 20 ثانية (اختبار إيجابي قوي).

حدث تراص متغير بين 20 ثانية ودقيقة واحدة (تأخر اختبار إيجابي).

درجة من التراص بعد دقيقة واحدة (اختبار مشكوك فيه). يوصى بتكرار الاختبار أو التأكيد بواسطة طريقة الأنبوب.

لا يوجد تراص (اختبار سلبي).

النتيجة مع SSF. يجب أن يكون دائمًا سلبيًا ، إذا كان إيجابيًا تلقائيًا ، يتم إبطال نتيجة الاختبار.

دليل على تجلط الدم في الأنبوب

المواد

- أنبوب اختبار معقم

-plasma

- حمام ماري عند 37 درجة مئوية.

تقنية

قياس مع ماصة معقمة 0.5 مل من البلازما ووضعه في أنبوب اختبار 12 × 75. تحميل حلقة البلاتين مع 2 إلى 4 مستعمرات نقية للدراسة من ثقافة صلبة من 18 إلى 24 ساعة وتذويبها في البلازما بعناية ، المزيج واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

افحص الأنبوب في الساعة الأولى دون أن تهتز ، قم بإمالة فقط برفق. إذا لم تظهر الجلطة بعد ، فيمكنك متابعة الملاحظة كل 30 دقيقة حتى يتم الانتهاء من 4 ساعات. إذا كانت بعد 4 ساعات لا تزال سالبة ، فيمكن تركها لمدة تصل إلى 24 ساعة ولكن في درجة حرارة الغرفة. مراقبة والإبلاغ عن النتيجة.

بناءً على الخبرة ، يوصي بعض علماء الأحياء المجهرية باستخدام 500 ميكرولتر من معلق بكتيري من ثقافة لمدة 18 ساعة في وسط سائل لإجراء الاختبار.

يبدو أنه يقدم نتائج أسرع وأكثر موثوقية مما كانت عليه عند استحلاب المستعمرات من الوسائط الصلبة ، خاصةً إذا تم استخدام البلازما البشرية التي تم الحصول عليها من بنك الدم.

يساعد استخدام سلالات المرق في تخفيف الوجود المحتمل للأجسام المضادة للمكورات العنقودية البشرية في البلازما والتي يمكن أن تمنع عمل تجلط الدم.

ترجمة

إذا لوحظ تجلط يغطي كل السائل (تجلط الدم الكامل) أو جلطة تسبح في السائل المتبقي (تجلط الدم الجزئي) يجب اعتباره بمثابة اختبار إيجابي.

إذا لم تتشكل الجلطة ، يكون التعليق متجانسًا ، يكون الاختبار سالبًا.

- اختبار تجلط الدم باستخدام الفيبرينوجين

يستخدم الفيبرينوجين بنفس طريقة البلازما ويخدم كلا من اختبار الشريحة واختبار الأنبوب. المضي قدما كما هو موضح للبلازما وتفسير بالطريقة نفسها.

استعمال

يتم استخدامه للتمييز بين المكورات العنقودية الذهبية من المكورات العنقودية سلبية المخثر.

مراقبة الجودة

لديك ثقافات جديدة من سلالة من المكورات العنقودية الذهبية لاستخدامها كعنصر تحكم إيجابية. يمكن أن تكون سلالة S. epidermidis متاحة أيضًا كعنصر تحكم سلبي.

القيود

- يجب عدم ترك اختبار إيجابي في الحضانة لمدة 24 ساعة ، لأن S. aureus ينتج الفيبرينوليزين الذي يذوب الجلطة.

- بالنسبة للاختبار الموثوق به ، يجب استخدام بلازما طازجة أو معاد تشكيلها حديثًا ، وكذلك من المهم استخدام الثقافات البكتيرية الطازجة (من 18 إلى 24 ساعة). هذا يمنع السلبيات الكاذبة.

- يجب أن يتم الاختبار مع التحكم السلبي والسيطرة الإيجابية.

-بعض الوسائط الصلبة يمكن أن تتداخل مع اختبار تجلط الدم. لا ينصح باستخدام المستعمرات من أجار مانيتول المالح.

- في حالة استخدام البلازما المسترجعة ، يوصى بوضع 5 وحدات من الهيبارين لكل مل من البلازما لتجنب الإيجابيات الخاطئة. وذلك لأن بعض الكائنات الحية الدقيقة بخلاف بكتريا المكورات العنقودية الذهبية (المكورات العنقودية الذهبية) يمكنها تحطيم السترات وتسبب تجلط البلازما في هذه الحالة ، يُنصح بإجراء اختبار Gram واختبار catalase.

- من المهم ، في اختبار الأنبوب ، مراقبة التفاعل كل 30 دقيقة ، لأن هناك سلالات من المكورات العنقودية الذهبية المذهبة التي تنتج تركيزات عالية من الفيبرينوليزين وتخفف من الجلطة المشكلة حديثًا بسرعة. تجنب السلبيات الخاطئة.

- عند مراقبة الاختبار يجب تجنبه لزعزعة الأنبوب فجأة ، وهذا يمكن أن يدمر بداية تكوين الجلطة التي لن يتم استعادتها ، مما يسبب سلبيات كاذبة.