اختبار Catalase: الأساس والتقنية والاستخدامات
اختبار الكاتلاز هو منهجية تستخدم في مختبرات علم البكتريا لإثبات وجود إنزيم الكاتلاز في تلك البكتيريا التي تمتلكها. جنبا إلى جنب مع تلوين غرام هي الاختبارات الرئيسية التي ينبغي إجراؤها على الكائنات الحية الدقيقة معزولة حديثا. هذه الاختبارات توجه عالم الأحياء المجهرية حول الخطوات الواجب اتباعها لتحديد الهوية الدقيقة للكائنات الحية موضع السؤال.
بشكل عام ، تمتلك البكتيريا المحتوية على السيتوكروم إنزيم الكاتالاز ، أي أن البكتيريا اللاهوائية الهوائية والخلوية يجب أن تمتلكها. ومع ذلك ، هناك استثناءات ، مثل العقدية ، التي على الرغم من كونها الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية اختيارية لا تمتلك انزيم الكاتالاز.
هذا هو السبب في أن اختبار الكاتالاز يستخدم بشكل رئيسي لتمييز العائلتين المكورات العنقودية والمكروكاسيا (كلاهما إيجابي الكاتلاز) من عائلة العقدية (الكاتالاز سلبية).
وبالمثل ، فإن جنس Bacillus (catalase إيجابي) يتميز عن جنس Clostridium (catalase سلبية) ، من بين أشياء أخرى.
مؤسسة
الكاتلاز هو إنزيم يصنف على أنه هيدروبروكسيديز ، وهذا يعني أنهم يستخدمون بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2 ) كركيزة.
كما أنه يعتبر مؤكسد ، لأنه في التفاعل حيث يوجد عنصر يعمل كمتبرع للإلكترون (مادة مختزلة) وآخر كمستقبل إلكترون (مادة مؤكسدة).
الكاتلاز هو بروتين يحتوي على مجموعة اصطناعية تحتوي على أربع ذرات من الحديد ثلاثي التكافؤ (Fe +++) ، وبالتالي فهو بروتين متماثل. يبقى أيون الحديديك يتأكسد أثناء التفاعل.
يمكن القول أن الكاتلاز هو إنزيم لإزالة السموم ، حيث أن وظيفته هي التخلص من المواد التي يتم إنتاجها أثناء عملية التمثيل الغذائي البكتيري والتي تكون سامة للبكتيريا. من بين هذه المواد بيروكسيد الهيدروجين.
يتكون بيروكسيد الهيدروجين من تحلل السكريات بواسطة المسار الهوائي. تحدث هذه العملية على النحو التالي:
يتشكل أيون الفائق أكسيد (O 2 -) (الجذور الحرة) كمنتج نهائي لاستيعاب الجلوكوز عن طريق المسار الهوائي. هذا مادة سامة ويتم التخلص منها بواسطة إنزيم ديسموتاز إنزيم الفائق الذي يحوله إلى أكسجين غازى وبيروكسيد الهيدروجين.
بيروكسيد الهيدروجين أيضًا سام للبكتيريا ويجب التخلص منه. إنزيم الكاتلاز يكشف عن بيروكسيد الهيدروجين في الماء والأكسجين.
يمكن أن يعمل الكالتيز على ركائز بخلاف بيروكسيد الهيدروجين ، مثل الكحول والألدهيدات والأحماض والأمينات العطرية والفينولات. ومع ذلك ، يمكن أيضًا استخدام بيروكسيد الهيدروجين بواسطة الكاتلاز لتأكسد المركبات السامة الأخرى مثل الميثيل وكحول الإيثيل.
وبالمثل ، يوجد الكاتلاز في خلايا البلعمة ، مما يحميه من التأثير السام لبيروكسيد الهيدروجين.
تقنية روتينية لاختبار الكاتالاز
- طريقة الهدف
المواد
3 ٪ بيروكسيد الهيدروجين (10 مجلدات).
زجاج الشريحة
مقبض من البلاستيك يمكن التخلص منها أو عصا خشبية.
عملية
خذ ما يكفي من المستعمرة للدراسة دون لمس أجار من أين أتت. يجب أن تكون المستعمرة جديدة ، أي من ثقافة تمتد من 18 إلى 24 ساعة.
ضع المستعمرة على الشريحة الجافة وعليها إضافة قطرة من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ (يمكن أيضًا استخدام 30٪ H 2 O 2 ). راقب على الفور ما إذا كانت الفقاعات تصدر أم لا.
ترجمة
رد فعل إيجابي: تطور الغاز ، والذي يتضح من تشكيل فقاعات (فقاعات قوية).
رد فعل سلبي: لا يوجد تشكيل فقاعة.
- طريقة مباشرة في الثقافة الخالصة
وضع 1 مل من 3 ٪ H 2 O 2 على ثقافة نقية في لوحات أو الأوتاد التي لا تحتوي على الدم (ويفضل أجار مغذية). لاحظ ما إذا كان تكوين الفقاعة موجودًا على الفور. يمكنك أيضًا استخدام H 2 O 2 بنسبة 30٪.
يتم تفسيره بنفس طريقة طريقة نقل الكائن.
-Method مع أنبوب شعري أو فونغ و Petrishko
ملء أنبوب شعري 67 ملم على ارتفاع 20 ملم مع بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3 ٪ من الشعرية.
المس المستعمرة المعزولة التي ترغب في دراستها بالشعيرات الدموية المملوءة بـ 3٪ H 2 O 2 . لاحظ ما إذا كان الشعيرات مليئة بالفقاعات في حوالي 10 ثوانٍ. تتيح هذه الطريقة تحديد رد الفعل في تقاطعات نصف:
بدون الصلبان لا توجد فقاعات (رد فعل سلبي).
+ ---- فقاعات صغيرة (رد فعل ضعيف أو متأخر).
++ فقاعات وفيرة (رد فعل معتدل).
+++ - الفقاعات تصل إلى الطرف المعاكس (رد فعل نشط).
- طريقة تايلور وأشنزار لاختبارات الكاتلاز التي تثير الشك
على شريحة جافة ونظيفة ، ضع مستعمرة معزولة ، ثم ضع قطرة بنسبة 0.5٪ H 2 O 2 وقم بتغطية ساترة. مراقبة ما إذا كان هناك أم لا تشكيل فقاعات المحاصرين.
التفسير: وجود فقاعات يشير إلى رد فعل إيجابي. بدون فقاعات ، يتم تفسيره على أنه رد فعل سلبي.
اختبار الكاتلاز لأنواع المتفطرة
يجب أن يتم هذا الأسلوب من خلال التحكم في درجة الحموضة ودرجة الحرارة. يجب تشغيله تحت غطاء تدفق الصفحي ، لأن التعامل مع الأنواع المختلفة من المتفطرات أمر خطير.
-Materials
بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30 ٪ أو 110 مجلدات (superoxal).
PH 7 الفوسفات العازلة
10 ٪ توين 80
زراعة الفطرية إسفين 3 إلى 4 أسابيع
- إعداد الكواشف
PH 7 الفوسفات العازلة
نأسف:
1.361 جم من فوسفات أحادي البوتاسيوم اللامائي (KH 2 PO 4 ).
1.420 غرام من فوسفات الصوديوم اللامائي (Na2HPO3).
يذوب الأملاح في القليل من الماء المقطر المعقم ويكتمل بالماء حتى 1000 مل.
10 ٪ توين 80
قم بتخفيف 1:10 إلى Tween 80 الذي يأتي مركّز تجاريًا ، لذلك تابع ما يلي:
خذ 1 مل من Tween 80 و ضعه في القليل من الماء المقطر ، ثم قم بإذابه ثم أكمل الحجم بالماء إلى 10 مل.
كاشف النهائي
خلط كمية من الفوسفات العازلة مع كمية 10 ٪ توين 80 (في أجزاء متساوية). حدد في المختبر مقدار ما تريد تحضيره.
الإجراء -a
مكان 5 مل من العازلة الفوسفات في أنبوب اختبار معقم مع غطاء المسمار (الباكليت).
مع حلقة التلقيح ، خذ مستعمرة كافية لنمو المتفطرة المصنفة في أسافين وتذوب في محلول الفوسفات.
تغطية الأنبوب دون تشديد الخيط أكثر من اللازم. مكان في حمام مائي عند 68 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. إزالة والسماح لتبرد في 22-25 درجة مئوية
قياس 0.5 مل من الكاشف النهائي (الخليط) وإضافته إلى أنبوب مع الحل البارد. مراقبة تشكيل أم لا من الفقاعات.
يتم تفسيرها مثل التقنيات السابقة.
استعمال
عندما يتم الحصول على نمو المستعمرات في الوسائط المخصبة ، يجب إجراء صبغة جرام واختبار الكاتالز على المستعمرات التي تم الحصول عليها. سيوجه هذا أخصائي علم الأحياء المجهرية حول الإجراءات الواجب اتباعها لتحديد الهوية بشكل نهائي.
مراقبة الجودة
لتقييم الأداء الصحيح لكاشف بيروكسيد الهيدروجين ، استخدم سلالات التحكم المستنبتة حديثًا ، مثل المكورات العنقودية الذهبية كعنصر تحكم إيجابي وسلالات المكورات العقدية sp كعنصر تحكم سلبي.
البديل الآخر الذي يعمل بمثابة عنصر تحكم إيجابي هو وضع قطرة من بيروكسيد الهيدروجين على أجار الدم ، الكريات الحمراء لديها الكاتلاز ، وبالتالي ، سيكون هناك فقاعات إذا كان الكاشف في حالة جيدة.
يمكن استخدام أجار الشوكولاتة كعنصر تحكم سلبي ، وهنا يتم القضاء على الكريات الحمراء بالفعل والاختبار سلبي.
القيود
- لا تستخدم الثقافات القديمة للاختبار ، لأن هذا قد يسبب سلبيات خاطئة.
- تجنب أخذ المستعمرات من الثقافات في أجار الدم ، إذا تم الحرص على عدم لمس أجار ؛ هذا الإجراء يمكن أن يسبب إيجابيات كاذبة ، لأن الكريات الحمراء تحتوي على الكاتالاز.
- إذا كنت تأخذ مستعمرة مع مقبض البلاتين لا عكس ترتيب الإجراء لأن هذا يمكن أن تولد إيجابيات كاذبة. وذلك لأن البلاتين قادر على التفاعل مع بيروكسيد الهيدروجين ، مما يسبب فقاعة.
- لا تستخدم كاشف بيروكسيد الهيدروجين إذا كان قديمًا للغاية ، لأن الكاشف غير مستقر للغاية ويميل إلى التحلل مع مرور الوقت.
- حافظ على كاشف بيروكسيد الهيدروجين محميًا من الضوء وفي التبريد لتجنب التلف.
- إجراء مراقبة الجودة من كاشف بيروكسيد الهيدروجين في كل مرة يتم استخدامه.
- ضع في الاعتبار أنه إذا تم استخدام H 2 O 2 بنسبة 30 ٪ ، فإن ردود الفعل تكون أقوى من تلك التي يتم إجراؤها باستخدام 3 ٪ H 2 O 2 .
